骨关节炎（OA）是最常见的关节疾病之一，是关节运动过程中慢性疼痛导致残疾的主要原因。然而，骨关节炎的发病机制是复杂的，目前仍知之甚少。因此迫切需要开发治疗骨关节炎安全有效的策略。通常，骨关节炎的特征是软骨退化、软骨细胞凋亡和滑膜慢性炎症。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是最重要的促炎细胞因子之一，参与包括骨关节炎在内的各种慢性炎症疾病。TNF-α的过度表达促进炎症，炎症通过诱导基质金属蛋白酶（MMP）的产生，特别是MMP-3和MMP-13的产生，在OA的发生和进展中起着至关重要的作用。
MMP-3和MMP-13负责II型胶原的降解。MMP还抑制SRY相关高迁移率族蛋白9（SOX-9）的表达，SOX-9是一种广泛公认的参与软骨形成的转录因子。因此，TNF-α是治疗骨关节炎常用的治疗靶点。干扰素调节因子（IRF）-1是骨关节炎中调节MMP转录的另一个关键因子。IRF-1的上调增强了MMP-3和MMP-13的表达，从而促进软骨降解。此外，据报道氧化应激是软骨细胞凋亡的效应物。活性氧的过量产生诱导JAK2/STAT1途径的激活，该途径调节细胞因子、酶和其他与骨关节炎相关因子的表达。 G蛋白偶联受体17（GPR17）是G蛋白偶联受体（GPCRs）超家族的一个孤儿受体。研究表明，GPR17在肺纤维化小鼠模型中可以介导促炎细胞因子如TNF-α的表达。这表明GPR17的阻断可能是治疗炎症相关疾病的一种有前途的方法。然而，GPR17在OA中的生理功能还没有研究。有报道称普仑司特对GPR17信号有抑制作用，被认为是一种合成的GPR17抑制剂，这为研究其在不同细胞中的作用提供了有力的工具。本研究的目的是研究普仑司特是否能通过阻断GPR17的激活而对II型胶原的降解起到保护作用。 基本信息 题目： Inhibition of GPR17 with pranlukast protects against TNF-α-induced loss of type II collagen in ATDC5 cells 期刊：International Immunopharmacology 影响因子：3.943 PMID：32805694 通讯作者：杨广勇 作者单位：温州医科大学附属台州医院 索莱宝合作产品： 产品名称 产品货号 Mouse MMP-13 ELISA KIT 摘 要 骨关节炎（OA）是一种常见的关节疾病，影响着全世界数百万的老年人。然而，OA的机制是复杂的，人们对其了解甚少。因此，安全有效的治疗策略还有待发展。G蛋白偶联受体17（GPR17）是一种广泛分布于中枢神经系统（CNS）的孤儿受体。GPR17已成为治疗脑部疾病炎症的靶点。在这项研究中，作者证明了GPR17在ATDC5细胞中表达，并且在肿瘤坏死因子-α（TNF-α）暴露时增加。作者还发现普仑司特拮抗GPR17可以通过下调细胞内活性氧（ROS）水平和增加超氧化物歧化酶（SOD）对TNF-α的活性而显著抑制氧化应激。有趣的是，普仑司特治疗可防止TNF-α诱导的II型胶原减少。此外，siRNA敲除GPR17可改善TNF-α诱导的II型胶原的降低，这表明GPR17在介导II型胶原损伤中具有重要的作用。普仑司特阻断GPR17，可抑制基质金属蛋白酶3（MMP-3）和基质金属蛋白酶13（MMP-13）的表达，MMP可导致II型胶原的降解。普仑司特还可以抑制JAK2/STAT1/IRF-1信号通路的激活，从而抑制促炎细胞因子和酶的表达。此外，普仑司特挽救了TNF-α诱导的SOX-9表达降低。总之，这些数据表明GPR17可能是治疗OA的潜在靶点。 研究内容及结果 1.GPR17在ATDC5细胞中表达 作者首先评估GPR17是否在ATDC5细胞中表达。为了评价GPR17的表达情况，作者以G422细胞作为阳性对照，因为GPR17在G422细胞中表达较高。图1A的RT-PCR分析结果显示，与G422细胞中的表达水平相比，ATDC5细胞中GPR17在基因水平上有良好的表达。同样，通过Western blot分析，作者证实GPR17在ATDC5细胞中在蛋白水平上高度表达，如图1B所示。 图1 2.TNF-α增加ATDC5细胞中GPR17的表达 接下来，作者测定了TNF-α对ARDC5细胞中GPR17表达的影响。图2A中的结果显示，与基线相比，三种剂量的TNF-α将GPR17的mRNA水平分别增加到1.7倍、2.3倍和2.8倍。图2B显示，经TNF-α处理后，GPR17的蛋白质水平升高到1.6倍、2.1倍和2.5倍。总的来说，TNF-α在基因和蛋白质水平上都表现出很强的促进GPR17表达的能力。 图2 3.普仑司特可降低TNF-α诱导的ATDC5细胞氧化应激 普仑司特的分子结构如图3A所示。为了确定普仑司特对TNF-α诱导的氧化应激的影响，作者测定了ROS和SOD的水平。如图3B所示，TNF-α诱导细胞内ROS水平增加了3.3倍，用5μM和10μM普仑司特处理后，细胞内ROS水平仅增加到2.4倍和1.6倍。同时，TNF-α将SOD活性降至15.6U/100mg蛋白质，而基线时为31.1U/100mg蛋白质。然而，5μM普仑司特将SOD活性提高到23.4U/100mg蛋白质，10μM普仑司特进一步将其提高到29.8U/100mg蛋白质（图3C），接近基线水平。普仑司特表现出剂量依赖性的抗氧化作用。 图3 4.普仑司特抑制TNF-α诱导的II型胶原减少 抑制细胞中II型胶原降解是预防和治疗OA的普遍靶点。这篇研究中，作者试图确定普仑司特对TNF-α诱导的II型胶原减少的影响。Col2a1的mRNA水平在单独暴露于TNF-α时降低到45%，而用5μM和10μM普仑司特处理时，Col2a1的mRNA水平分别上升到68%和92%，结果如图4A所示。图4B显示，与上述相同剂量的普仑司特可使Ⅱ型胶原的蛋白质含量提高到71%和94%，而TNF-α处理组的Ⅱ型胶原的蛋白质含量为51%。 图4 5.GPR17的敲除在基因和蛋白水平上都阻止了TNF-α诱导的II型胶原减少 普仑司特作为GPR17的公认拮抗剂，其对ATDC5细胞的保护作用可能是通过阻断GPR17的表达而实现的。为了验证这一理论，作者使用siRNA沉默GPR17的表达（图5A）。图5B和5C的结果显示，GPR17的敲除对TNF-α诱导的Col2a1基因和II型胶原蛋白的减少具有保护作用。这些发现表明GPR17的表达介导II型胶原的减少。 在补充材料中，作者检测了普仑司特对GPR17表达的影响。结果表明，普仑司特在基础条件下和TNF-α处理下均降低了GPR17在mRNA水平和蛋白水平上的表达。重要的是，作者发现GPR17的过表达消除了普仑司特对Col2a1基因表达和II型胶原蛋白表达的保护作用。这些研究结果表明，普仑司特对TNF-α诱导的II型胶原减少中的有益作用是通过抑制GPR17介导的。 图5 6.普仑司特在ATDC5细胞中可恢复TNF-ɑ诱导的SOX-9的减少 SOX-9是一种在软骨形成中起重要作用的转录因子。SOX-9的表达对抑制TNF-α诱导的II型胶原降解具有重要作用。如图6A中所示，TNF-α诱导SOX-9的mRNA水平降低52%，分别用5μM和10μM普仑司特处理后可增加到73%和95%。与单独TNF-α处理组相比（55%），与上述相同剂量的普仑司特将SOX-9的蛋白质水平分别提高到76%和97%（图6B）。 图6 7.普仑司特在ATDC5细胞中可降低TNF-ɑ诱导的MMP-3和MMP-13的表达 由于MMP-3和MMP-13被认为是参与II型胶原降解的最重要的酶，因此作者确定了普仑司特对这两种蛋白表达的影响。图7A显示，TNF-α刺激后，MMP-3和MMP-13的mRNA水平分别增加了3.2倍和3.9倍。然而，5μM的普仑司特将MMP-3和MMP-13 mRNA水平分别降低到2.1倍和2.3倍，10μM的普仑司特将MMP-3和MMP-13 mRNA水平分别降低到1.5倍和1.7倍。与之一致的是，图7B的结果显示，经TNF-α处理后，MMP-3和MMP-13的蛋白水平上升至342.3pg/mL和645.3pg/mL，高于基线时的89.5pg/mL和139.2pg/mL。同时，5和10μM普仑司特将MMP-3的蛋白水平分别降低到265.7和185.6pg/mL，MMP-13的蛋白水平分别降低到466.9和327.5pg/mL。 图7 8.普仑司特在ATDC5细胞中可抑制TNF-ɑ诱导的IRF-1的表达 MMP-3和MMP-13受IRF-1的转录调控。在这里，作者测定了普仑司特对TNF-α诱导的IRF-1表达的影响。图8A的结果显示，TNF-α诱导IRF-1在基因水平上的表达增加了3.2倍，而用5μM和10μM普仑司特处理后，IRF-1的表达分别下降到2.1和1.4倍。如预期一致，图8B所示，两剂量的普仑司特分别将IRF-1的蛋白水平降低到1.9倍和1.5倍，相比之下，单独使用TNF-α处理的IRF-1蛋白水平为2.9倍。最后，图8C的免疫染色结果显示，单独TNF-α处理后，IRF-1的表达明显增加到3.2倍。然而，5μM普仑司特可使IRF-1水平降低到2.2倍，10μM普仑司特可使IRF-1水平进一步降低到1.6倍。 图8 9.普仑司特抑制TNF-α诱导的JAK2/STAT1通路的激活 JAK2/STAT1通路已被证明在OA中调节细胞因子和MMPs的产生中发挥关键作用。这项研究中，作者确定了普仑司特阻断GPR17是否会抑制JAK2/STAT1通路的激活。如图9所示，Western Blot分析显示，与基线相比，TNF-α处理显著提高了p-JAK2和p-STAT1的水平，约为2.7倍和2.9倍。而5μM普仑司特抑制p-JAK2和p-STAT1的表达，分别为2.1倍和1.9倍。此外，10μM普仑司特进一步将这些值降低到1.5和1.4倍。普仑司特对TNF-α诱导的JAK2/STAT1通路的激活具有较强的抑制作用。
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