肾透明细胞癌致瘤机制：KDM5C基因缺失致使糖原代谢重编和抑制铁死亡

文章标题：Deficiency of the X-inactivation escaping gene KDM5C in clear cell renal cell carcinoma promotes tumorigenicity by reprogramming glycogen metabolism and inhibiting ferroptosis

发表期刊：Theranostics

发表时间：2021.08.04

影响因子：11.556

合作客户：武汉大学

百趣生物提供的服务：PPP、EMP靶标代谢流代谢组学检测

研究背景

肾透明细胞癌 (ccRCC) 是最常见的肾癌形式，病症表现为富含脂质和糖原的细胞质沉积物增加。研究表明，ccRCC中诸多基因位点发生突变，其中VHL基因和染色质修饰基因KDM5C。尽管已证明VHL缺失可导致糖原累积，X染色体上KDM5C基因失活逃逸导致男性为主要患者，但其潜在机制仍不清楚。

此外，ccRCC患者存活率较低可能与磷酸戊糖途径(PPP)的上调有关，因此糖原代谢可以作为治疗靶点，但是，ccRCC中糖原累积和相关致癌功能的遗传因素尚不完全清楚。

本文利用全外显子组与RNA测序评估KDM5C在ccRCC中的功能，结合靶标代谢组学代谢流研究KDM5C如何影响细胞内代谢通量。同时还对小鼠进行KDM5C基因敲除收集更多的体内证据，揭示了组蛋白修饰基因失活突变重编程糖原代谢的机制，并有助于解决人类癌症中男性占主导地位的长期难题。

研究内容

具有最高糖原水平的 ccRCC 细胞系存在着 KDM5C 基因移码突变

对ccRCC 6个细胞系进行高碘酸-希夫 (PAS) 染色和糖原定量测定发现，相比于其他同样缺乏 VHL基因的癌细胞系，RCC4表现出最高的糖原水平（图1 A、B）。此外，外显子测序结果表明RCC4细胞中KDM5C和VHL出现移码和错义突变，WB结果发现RCC4细胞中不存在KDM5C和VHL蛋白（图1 C、D），由此表明癌细胞中的高糖原水平可能与KDM5C突变有关。

为了验证KDM5C的恢复是否会降低RCC4细胞中的糖原水平，构建了野生型KDM5C或其酶失活突变体H514A的RCC4细胞系，PAS染色结果和糖原定量测定结果表明KDM5C能有效降低糖原水平（图1 E、F），KDM5C突变促进ccRCC中糖原的形成。

鉴于KDM5C是X失活逃逸基因，作者分析不同性别的患者的情况，发现在ccRCC中频繁突变的基因中，KDM5C突变表现出最高的男女比例（图1 G），KDM5C蛋白水平在ccRCC患者中下降，同时糖原显著增加（图1 H），这就解释了为什么ccRCC患者大部分为男性。

图1. X失活逃逸基因KDM5C在糖原水平最高的ccRCC细胞系中具有移码突变

KDM5C缺失引起ccRCC特异性代谢组学表型

为了证实KDM5C缺失导致ccRCC发生和糖原积累，作者进行KDM5C敲除实验。在对照组中，雌性肾脏中的KDM5C蛋白水平高于雄性（图2 A）。相比于对照组，在50%的KDM5C敲除小鼠中观察到肾囊肿（图2 B），其管腔的上皮细胞显示出强Ki67染色（图2 C），KDM5C敲除小鼠的肾小管表现出细胞质糖原累积升高（图2 D）, 表明KDM5C缺失可能引发ccRCC特异性代谢组学表型并促进肿瘤形成。另外，KDM5C敲除稳定细胞系的PAS染色和糖原定量结果均表明KDM5C耗尽后糖原水平增加（图2 E-H）。

图2. KDM5C敲除引发ccRCC特异性代谢表型

为了明确VHL和KDM5C两者在糖原累积作用的联系，作者另外对Caki-1细胞进行敲除实验，发现VHL和KDM5C任何一种缺失都会导致糖原累积，二者同时敲除存在累加效应，表明KDM5C可能具有独立于VHL/HIF的调节糖原的能力。（图3）

图3. 构建的caki-1细胞系的糖原水平

KDM5C组蛋白去甲基化酶活性是其在调节参与糖生成、糖原分解和PPP的基因表达的作用所必需的

为了探索KDM5C在糖原代谢中的作用机制，作者对ACHN-shKDM5C、 RCC4-KDM5C细胞系以及对照组进行转录测序。结果发现KDM5C基因与中枢代谢、HIF反应、氨基糖代谢和转录失调相关，表明KDM5C对细胞代谢调节至关重要（图4 A、B）。除此之外，鉴定了几个参与糖原合成/降解和PPP的基因，包括HK2、GYS1、PGM1、PPP1R3C以及控制葡萄糖向PPP流动的关键基因G6PD，这些基因均在KDM5C敲除后表现出高表达，由此表明KDM5C可能会抑制ccRCC细胞中的HIF基因表达和葡萄糖向PPP分流（图4 C-E）。

WB结果表明KDM5C表达会降低基因启动子的H3K4me3水平（图4 F），且KDM5C敲除会导致除了PPP1R3C之外的那些基因的启动子上H3K4me3的水平增加（图4 G），表明KDM5C能够直接调节HK2、GYS1、PGM1和G6PD的基因表达。由此得到一个结论：KDM5C缺失导致H3K4me3水平提升进而促进糖原相关基因的表达。

图4. KDM5C 抑制糖原代谢需要组蛋白去甲基化酶活性

KDM5C抑制葡萄糖向PPP的流动

尽管上述结果表明KDM5C可以同时调节糖原代谢和PPP，但其具体调控的方向仍不清楚。于是作者利用靶标代谢组学代谢流技术确认KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流动。结果发现在恢复KDM5C的RCC4细胞中，G6P、6-PG、R5P、EMP的F6P和乳酸的同位素信号显著减弱（图5 A）,表明KDM5C抑制了葡萄糖向PPP的流动和糖酵解。此外，细胞内代谢物定量结果发现RCC4中的G6P水平高于其他ccRCC细胞系（图5 B），KDM5C抑制了参与PPP和糖酵解的几种产物的产生（图5 C和D）。

百趣生物了解到，有趣的是，KDM5C同样有效降低了G6P和NADPH的水平（图5 E）, 尽管VHL降低了糖原含量，但未能降低G6P和NADPH的水平。与其他代谢物类似，KDM5C突变降低GSH水平。同样，KDM5C缺失导致ccRCC细胞系的PPP底物G6P、PPP产物NADPH和GSH增加（图4 F）。

图5. KDM5C通过戊糖磷酸途径抑制葡萄糖通量

KDM5C主要通过促进铁死亡来抑制致瘤性

PPP在抗ROS活性和肿瘤侵袭上具有重大意义，其中间产物NADPH是铁死亡的指标。为了明确KDM5C在ROS抗性和铁死亡中的潜在作用，作者通过ROS诱导处理来比较各种ccRCC细胞系ROS抗性。与其他ccRCC细胞系相比，RCC4表现出相对较高的ROS抗性（图6 A）。在用TBHP处理后，与RCC4-H514A细胞相比，RCC4-KDM5C有更多的细胞死亡（图6 B）。同时，在TBHP诱导下，KDM5C导致ROS水平显着增加（图6 C）。此外，KDM5C显著增强了Erastin介导的细胞死亡（图6 B），这可以被Ferr-1或DFO有效逆转，但不能被Z-VAD或Nec-1s逆转。因此，与RCC4-H514A细胞相比，RCC4-KDM5C细胞中Erastin诱导的脂质过氧化增加更明显（图6 D）。

图6. KDM5C主要通过抑制铁死亡来抑制致瘤性

KDM5C敲除赋予癌细胞对ROS和铁死亡的抵抗力

敲除KDM5C后，与几种ccRCC细胞系对TBHP和Erastin的抵抗力显著增强（图7 A、B）。值得注意的是，在糖原磷酸化酶抑制剂(GPI)会抑制其抗性（图7 C），这表明KDM5C蛋白介导的糖原重编程的缺失对于抗ROS和铁死亡是必不可少的。

图7. KDM5C的缺失使老化的肾细胞和ccRCC细胞对铁死亡具有抗性

癌症相关的KDM5C突变在抑制糖原积累和促进铁死亡方面存在缺陷

测序鉴定到大部分突变在JmjN和JmjC结构域中富集（图8 A），为了评估这些癌症相关的KDM5C突变对糖原积累和铁死亡的影响，选择了几个JmjN和JmjC结构域相关的错义突变，并构建了稳定表达突变蛋白的相应RCC4细胞系（图8 A）。有趣的是，所有这些突变体都表现得像H514A，不能有效地降低糖原和G6P水平（图8 B），并且它们都没有使细胞对铁死亡或ROS诱导剂敏感（图8 C)。

图8. 临床相关的KDM5C突变体未能降低糖原水平并抑制铁死亡

基于前面的结果，百趣生物发现作者提出了ccRCC中失活KDM5C突变的模型。如图9所示，雌性KDM5C有两个活性等位基因；因此，在单个基因改变后，雌性不会完全丧失基因。相比之下，在男性中，一个肾细胞突变使KDM5C基因的唯一等位基因失活，从而可能通过增加糖原生成/糖原分解和抑制铁死亡来促进肿瘤发生。因此，男性更容易患ccRCC。

图9. 失活KDM5C突变和ccRCC发病模型

结 论

该文章揭示了组蛋白修饰基因KDM5C失活突变重编程糖原代谢和随后的PPP，并诱导了铁死亡抗性，从而扩展了KDM5C功能库，这些功能对于ccRCC的肿瘤发生至关重要，有助于解释人类癌症中男性占主导地位的长期难题。此外，该研究结果可能表明在ccRCC中靶向糖原代谢的治疗价值。

文/阿趣代谢组学