水蛭素（HR）基因蛋白联免疫分析（ELISA）

试剂盒使用说明书

本试剂盒仅供研究使用。

药品名称：

通用名：水蛭素（HR）基因蛋白联免疫分析试剂盒

使用目的：

本试剂盒用于测定相关液体样本中水蛭素（HR）含量。

实验原理

本试剂盒应用间接法测定标本中水蛭素（HR）基因蛋白水平。用纯化的水蛭素（HR）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入已知浓度的水蛭素（HR）标准品和未知浓度的水蛭素（HR）待检样品，温育后，加入生物素标记的抗IgG抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的水蛭素（HR）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中水蛭素（HR）浓度。

试剂盒组成

标本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

操作步骤

1.       根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。

2.       加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。然后在标准品孔中加入标准品50μl，在样本反应孔中先加入待测样品10μl再加入样品稀释液40μl（样品最终稀释度为5倍），盖上封板膜，轻轻振荡混匀，37℃温育45分钟。

3.       配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用

4.       洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复4次，拍干。

5.       加生物素标记的抗-IgG抗体：每孔加入生物素标记的抗-IgG抗体50μl。37℃温育30分钟

6.       洗涤：操作同4。

7.       加链霉亲和素-HRP：每孔加入50μl的链酶亲和素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。

8.       洗涤：操作同4。

9.       显色：每孔先加入显色剂A 50μl，再加入显色剂B 50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.   终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.   测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。 测定应在加终止液后15分钟以内进行。

计算

  以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度；再乘以稀释倍数；或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值待入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

注意事项

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

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